油菜PEPase基因的克隆及其对应RNAi载体的构建

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPase)是控制油菜蛋白质/油脂含量比例的一个关键酶.采用RT-PCR方法从甘蓝型油菜中双4号中扩增出PEPase基因cDNA片段,与已发表的PEPase基因(登录号为D13987)序列同源性为98%.根据RNA 干扰(RNAi)目标序列的选取原则选取两段长度约为400bp的DNA序列,分别克隆到RNAi载体pHBM1301中,构建了油菜中对应于PEPase基因的RNAi载体pHBM1301-PEP1和pHBM1301-PEP2.     

水稻剑叶全氮含量及其变化的遗传分析

 以籼稻品种IR24 和粳稻品种Asominori 及其染色体片段置换系（CSSLs）群体为遗传研究材料, 在抽穗后5个不同时期分别测定剑叶全氮含量，并结合水稻RFLP分子标记连锁图谱,对水稻剑叶全氮含量性状进行QTL的动态定位，探讨了控制剑叶全氮含量基因在水稻发育过程中的时序表达方式。在抽穗后各时期共检测到7个QTL, 位于第2和第11染色体上的2个QTL（QN 2、QN 11）增效基因来自粳稻品种Asominori，其他QTL的增效基因来自籼稻IR24；抽穗后2周内检测到2个QTL，即QN 3和QN 8b, 其加性效应值较大, 解释表型变异的贡献率较高；后期检测到的QTL加性效应和贡献率较低，位于第2染色体上R3393的QN 2位点的基因在抽穗后第3周内表达, 位于第8染色体上G1149的QN 8位点的基因在抽穗后第4周内表达，位于第11染色体上G1465的QN 11位点的基因在抽穗后４周和５周持续表达。控制剑叶全氮含量的基因在抽穗后早期表达较为活跃，可以应用于改良水稻品种的剑叶光合功能；在测定末期检测到的控制剑叶全氮含量的QTL，则可以用于延缓叶片早衰的育种改良。     

甜樱桃PaMADS4基因克隆及其表达分析

为研究甜樱桃在高温下胚囊发育的分子机理,以甜樱桃品种‘拉宾斯’为试材,采用RT-PCR结合RACE方法克隆胚囊发育相关的MADS-box SEP类基因c DNA全长,使用半定量PCR法进行特异性表达分析,通过温室和露地环境PaMADS4实时荧光定量分析不同温度下的表达。克隆得到一个基因全长999 bp,命名为PaMADS4(Gen Bank登录号:JQ686726),包含一个735 bp的开放阅读框,编码244个氨基酸;序列比对和进化分析表明,PaMADS4与拟南芥SEP基因家族亲缘关系最近;组织特异性分析表明PaMADS4在四轮花器官中均表达;开花后PaMADS4在露地中的表达量明显大于温室。     

几个常用玉米自交系主要数量性状的配合力分析

采用P（P－1）／2完全双列杂交设计4，对8个常用玉米自交系主要数量性状进行一般配合力和特殊配合力分析。结果表明8个性状同时受加性和非加性效应控制，以加性效应为主，在选育亲本或者组配时，不能只考虑一般配合力或者特殊配合力，要综合考察配合力总效应。研究还发现穗粗、株高、穗位高的遗传力较高，在早代进行选择便可收到显著成效；而茎粗、穗行数受环境影响较大，在后期选择方可取得良好效果。     

大豆脱氢抗坏血酸还原酶基因的电子克隆及进化分析

利用生物信息学和实验验证的技术路线,以拟南芥脱氢抗坏血酸还原酶基因cDNA序列为信息探针,对大豆EST数据库进行同源搜索,经同源性比对和序列组装,获得全长为955bp的大豆脱氢抗坏血酸还原酶基因的cDNA序列(GenBank登录号为DQ006810),经RT-PCR扩增,分子克隆和序列分析验证,结果表明与电子克隆完全一致.该cDNA序列具有完整的开放阅读框架(ORF,36bp-815bp),推测编码蛋白为259个氨基酸.通过与几种植物脱氢抗坏血酸还原酶蛋白序列的比较,发现该基因具有较高的保守性.结果表明根据物种问同源基因序列,对跨物种问EST数据库进行同源检索筛选,拼接,是新基因克隆的一条有效途径.     

梨褪绿叶斑伴随病毒的RT-PCR和巢式RT-PCR检测技术建立

 梨褪绿叶斑伴随病毒(Pear chlorotic leaf spot-associated virus,PCLSaV)是新近发现的为害梨树的欧洲花楸环斑病毒属(Emaravirus)病毒,该病毒基因组由5条负义单链RNA组成。本研究比较分析了反转录引物pd(N)6、3C和5H及基于该病毒基因组RNA3和RNA5链序列设计的4对引物用于RT-PCR检测梨样品中PCLSaV的效果,结果显示,采用与该病毒基因组RNA链3′末端互补的引物3C用于cDNA合成及基于该病毒RNA5链序列的引物5-F/R用于PCR扩增时,检测PCLSaV的灵敏度相较采用引物pd(N)6和5H合成cDNA为模板时高10~100倍;不同部位和不同发病状况的梨树组织中PCLSaV检测结果差异明显。进一步建立了具有高灵敏度的巢式RT-PCR技术,采用外侧引物5-F/R和内巢引物5-IF/IR结合可用于梨不同组织样品中PCLSaV的检测。本研究为系统分析PCLSaV在我国栽培梨树上的危害状况及无病毒梨种质培育奠定了技术基础。     

杨梅衰弱病根际土壤真菌的定量检测与分析

 杨梅衰弱病在杨梅主产区发生严重,但其成因尚未明确。为明确根际土壤真菌与衰弱病的相关性,本研究以来自仙居、临海和兰溪3个不同地区的健康植株和衰弱植株的根际土壤为材料,利用实时荧光定量PCR技术,对14种与连作障碍相关的土壤真菌进行了定量检测与分析。结果表明:杨梅根际真菌群体的含量比较丰富;被孢霉属(Mortierella spp.)和轮枝孢属(Verticillium spp.)在发病植株根际的含量均显著高于健康植株,与杨梅衰弱病呈正相关关系;青霉菌属(Penicillium spp.)在发病植株根际的含量显著低于健康植株,与杨梅衰弱病呈负相关关系。本研究建立了杨梅根际土壤真菌的快速检测体系,明确了健康株和衰弱株根际真菌菌群的差异,为杨梅衰弱病的研究和病害防控提供参考。     

桑椹菌核病菌实时荧光定量PCR检测体系的建立和应用

为及时高效地鉴别桑椹菌核病的病原菌桑实杯盘菌Ciboria shiraiana和肉阜状杯盘菌C. carunculoides,根据RPB2基因序列设计引物并验证其特异性,建立这2种病原菌的实时荧光定量PCR(real-time fluorescent quantitative PCR,q PCR)检测体系,运用该体系对抗、感果桑品种不同时间点芽(果)内的2种病原菌进行检测。结果表明,设计的2对引物特异性强,qPCR检测灵敏度均为10^-4ng/μL,均为常规PCR灵敏度的10~5倍,建立的桑实杯盘菌和肉阜状杯盘菌qPCR标准曲线的扩增效率分别为104.89%和95.30%。利用所建方法成功从采集的果桑样品中检测出病原菌主要为肉阜状杯盘菌,且感病品种中肉阜状杯盘菌的含量随着时间不断增加,在将要显症时激增。表明所建qPCR体系适用于桑椹菌核病早期无症状芽(果)的检测,可通过监测其病原菌类型和含量为该病害的预测预报及早期防治提供依据。